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揭秘:細(xì)胞株是如何構(gòu)建的?
更新時間:2021-03-23   點擊次數(shù):1467次
1, 什么時候需要穩(wěn)定細(xì)胞株?
 
以下實驗,構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株而不是瞬時轉(zhuǎn)染geng能滿足實驗要求:
 
1),外源片段在分裂細(xì)胞中長期(>2周)穩(wěn)定表達(dá)。雖然普通轉(zhuǎn)染實驗一般只能保證2-4天的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率,但腺載體在多數(shù)分裂細(xì)胞中可以維持2-4周內(nèi)的高轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)周期。而非分裂細(xì)胞,可以使用腺相關(guān)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因,因為腺相關(guān)載體在許多非分裂細(xì)胞中可以保持長達(dá)1年的高效表達(dá)。
 
2),需要構(gòu)建使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),這主要是由于:a),過表達(dá)基因或者干擾目的基因引起細(xì)胞毒性或者抑制細(xì)胞生長等不利因素; b),目的基因的過表達(dá)或者干擾需要時空特異性。
 
3),希望控制目的基因過表達(dá)或者干擾的拷貝數(shù),以避免引入人為因素影響實驗結(jié)果的精-確性。構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實驗研究。
 
4),部分細(xì)胞種類,載體亦無法達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,通過構(gòu)建穩(wěn)定株,達(dá)到外源片段的高效表達(dá)。
 
5),長期在少數(shù)幾類細(xì)胞中研究幾個基因的功能,通過構(gòu)建穩(wěn)定株,可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者包裝的成本,也極-大方便實驗研究。
 
6),部分蛋白穩(wěn)定性*,瞬時RNA干擾因為作用周期短,只能抑制目的基因的表達(dá),但無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白,所以需要通過構(gòu)建穩(wěn)定株實現(xiàn)geng好的基因干擾效果。
 
7),需要往動物體內(nèi)注射表達(dá)有外源片段的細(xì)胞。需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株,以防止注射入動物體內(nèi)后,很快外源片段表達(dá)丟失。
 
8),細(xì)胞個體差異(同一類細(xì)胞,不同個體細(xì)胞基因組存在差異)對實驗結(jié)果有干擾,需要構(gòu)建單克隆細(xì)胞株去除干擾。
 
9),需要將外源片段插入基因組中,比如基因敲除,基因插入突變篩選等修飾基因組的實驗。
 
2, 什么時候不需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株?
 
以下實驗不需要構(gòu)建穩(wěn)定株:
 
1),希望迅速觀察目的基因過表達(dá)或者干擾效果。例如在正式實驗之前進(jìn)行的小規(guī)模預(yù)實驗。
 
2),2-4天的瞬時表達(dá)已經(jīng)可以達(dá)到具體的實驗?zāi)康?,比如檢測兩個外源轉(zhuǎn)染的目的蛋白之間的相互作用,或者觀察某些細(xì)胞周期抑制,凋亡或細(xì)胞存活相關(guān)基因的細(xì)胞表型。
 
3),細(xì)胞個體差異對實驗結(jié)果有影響。體外培養(yǎng)非原代細(xì)胞,多為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或者癌細(xì)胞,細(xì)胞個體差異大,瞬時轉(zhuǎn)染或者使用/腺相關(guān)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)geng可以反映細(xì)胞群體行為。或者使用逆轉(zhuǎn)錄載體構(gòu)建混合穩(wěn)定株。
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